Змеиный яд содержит ферменты, гидролизующие карбоксиэфирные связи.Субстратами для гидролиза являются фосфолипиды, ацетилхолин и ароматический ацетат.Эти ферменты включают три вида: фосфолипазу, ацетилхолинэстеразу и ароматическую эстеразу.Аргининэстераза в змеином яде также может гидролизовать синтетический аргинин или лизин, но в природе она в основном гидролизует белковые пептидные связи, поэтому относится к протеазе.Обсуждаемые здесь ферменты действуют только на сложноэфирные субстраты и не могут действовать ни на какие пептидные связи.Среди этих ферментов биологические функции ацетилхолинэстеразы и фосфолипазы более важны и полностью изучены.Некоторые змеиные яды обладают сильной ароматической эстеразной активностью, которая может гидролизовать п-нитрофенилэтиловый эфир, а- или п-ацетат нафталина и этиловый эфир индола.До сих пор неизвестно, вызвана ли эта активность независимым ферментом или известным побочным эффектом карбоксиэстеразы, не говоря уже о ее биологическом значении.При взаимодействии яда Agkistrodon halys Japonicus с п-нитрофенилэтиловым эфиром и индолэтиловым эфиром гидролизаты п-нитрофенола и индолфенола не обнаружены;Наоборот, если эти эфиры вступают в реакцию с ядом змеи кобры подвида Чжоушань и ядом змеи Bungarus multicinctus, они будут быстро гидролизоваться.Известно, что эти яды кобры обладают сильной холинэстеразной активностью, которая может быть ответственна за гидролиз вышеуказанных субстратов.Фактически, Маклин и др.(1971) сообщили, что многие змеиные яды, принадлежащие к семейству кобр, могут гидролизовать индолэтиловый эфир, нафталинэтиловый эфир и бутилнафталиновый эфир.Эти змеиные яды происходят от: кобры, черношейной кобры, черногубой кобры, золотой кобры, египетской кобры, королевской кобры, золотой кобры мамбы, черной мамбы и белой мамбы
Яд змеи может гидролизовать метиловый эфир индола, который является субстратом для определения активности холинэстеразы в сыворотке крови, но этот змеиный яд не проявляет активности холинэстеразы.Это показывает, что в яде кобры есть неизвестная эстераза, которая отличается от холинэстеразы.Чтобы понять природу этого фермента, необходима дальнейшая работа по разделению.
1. Фосфолипаза А2.
(I) Обзор
Фосфолипаза представляет собой фермент, способный гидролизовать глицерилфосфат.В природе существует 5 видов фосфолипаз, а именно фосфолипаза А2 и фосфолипаза.
A., фосфолипаза B, фосфолипаза C и фосфолипаза D. Змеиный яд в основном содержит фосфолипазу A2 (PLA2), некоторые змеиные яды содержат фосфолипазу B, а другие фосфолипазы в основном обнаруживаются в тканях животных и бактериях.На рис. 3-11-4 показано место действия этих фосфолипаз при гидролизе субстрата.
Среди фосфолипаз больше изучена PLA2.Возможно, это наиболее изученный фермент змеиного яда.Его субстратом является сложноэфирная связь во втором положении Sn-3-глицерофосфата.Этот фермент широко распространен в змеином яде, пчелином яде, яде скорпиона и тканях животных, а PLA2 в изобилии содержится в ядах четырех семейств змей.Поскольку этот фермент разрушает эритроциты и вызывает гемолиз, его также называют «гемолизин».Некоторые люди также называют PLA2 гемолитической лецитиназой.
Людик впервые обнаружил, что змеиный яд может производить гемолитическое соединение, воздействуя на лецитин через ферменты.Позже Делезенн и соавт.доказали, что при действии яда кобры на лошадиную сыворотку или желток образуется гемолитическое вещество.В настоящее время известно, что PLA2 может непосредственно действовать на фосфолипиды мембраны эритроцитов, разрушая структуру мембраны эритроцита и вызывая прямой гемолиз;Он также может воздействовать на сыворотку или добавленный лецитин с образованием гемолитического лецитина, который действует на эритроциты, вызывая непрямой гемолиз.Хотя PLA2 в изобилии содержится в четырех семействах змеиных ядов, содержание ферментов в разных змеиных ядах немного отличается.Гремучая змея (С
Змеиный яд показал только слабую активность PLA2.Таблица 3-11-11 иллюстрирует сравнение активности PLA2 10 основных ядов ядовитых змей в Китае.
Таблица 3-11-11 Сравнение активности фосфолипазы VIII 10 змеиных ядов в Китае
Змеиный яд
Высвобождение жира
Алифатическая кислота,
Cюмоль/мг)
Гемолитическая активность CHU50/^г*мл)
Змеиный яд
Высвобождение жирных кислот
(^раол/мг)
Гемолитическая активность» (HU50/ftg * 1111)
Наджанаджа атра
9. 62
одиннадцать
Микрацефал ophis
пять целых один ноль
калиспалла
8. 68
две тысячи восемьсот
изящная
В, острый
7. 56
* * #
Офиофаг Ханна
три целых восемь десятых два
сто сорок
Bnugarus fasctatus
7,56
двести восемьдесят
Б. мультицинктус
одна точка девять шесть
двести восемьдесят
Гадюка Расселли
семь целых ноль три
Т, мукроскваматус
одна точка восемь пять
сиамский
Т. стейнегери
0,97
(2) Разделение и очистка
Содержание PLA2 в змеином яде велико, и он устойчив к нагреванию, кислоте, щелочи и денатурантам, поэтому его легко очищать и отделять PLA2.Обычный метод заключается в том, чтобы сначала провести гель-фильтрацию неочищенного яда, затем провести ионообменную хроматографию, и следующий шаг можно повторить.Следует отметить, что лиофилизация ПЛА2 после ионообменной хроматографии не должна вызывать агрегацию, так как процесс лиофилизации часто увеличивает ионную силу в системе, что является важным фактором, вызывающим агрегацию ПЛА2.В дополнение к вышеупомянутым общим методам также были приняты следующие методы: ① Wells et al.② Аналог субстрата PLA2 использовали в качестве лиганда для аффинной хроматографии.Этот лиганд может связываться с PLA2 в змеином яде с помощью Ca2+.ЭДТА в основном используется в качестве элюента.После удаления Ca2+ сродство между PLA2 и лигандом снижается, и он может диссоциировать от лиганда.Другие используют 30% органический раствор или 6 моль/л мочевины в качестве элюента.③ Гидрофобную хроматографию проводили с PheiiylSephar0SeCL-4B для удаления следовых количеств PLA2 в кардиотоксине.④ Антитело против PLA2 использовали в качестве лиганда для проведения аффинной хроматографии на PLA2.
До сих пор было очищено большое количество змеиного яда PLAZ.Ту и др.(1977) перечислили PLA2, очищенный от змеиного яда до 1975 года. В последние годы ежегодно появляется большое количество статей о выделении и очистке PLA2.Здесь мы сосредоточимся на разделении и очистке PLA китайскими учеными.
Чен Юаньцун и др.(1981) выделили три вида PLA2 из яда Agkistrodon halys Pallas в Чжэцзяне, которые можно разделить на кислые, нейтральные и щелочные PLA2 в соответствии с их изоэлектрическими точками.По своей токсичности более токсичен нейтральный PLA2, который идентифицирован как пресинаптический нейротоксин Agkistrodotoxin.Щелочной PLA2 менее токсичен, а кислый PLA2 почти не токсичен.У Сянфу и др.(1984) сравнили характеристики трех PLA2, включая молекулярную массу, аминокислотный состав, N-конец, изоэлектрическую точку, термостабильность, ферментативную активность, токсичность и гемолитическую активность.Результаты показали, что они имели одинаковую молекулярную массу и термическую стабильность, но имели значительные различия в других аспектах.Что касается ферментативной активности, активность кислых ферментов была выше, чем активность щелочных ферментов;Гемолитическое действие щелочного фермента на эритроциты крысы было самым сильным, за ним следовал нейтральный фермент, кислый фермент почти не гемолизировался.Поэтому предполагается, что гемолитический эффект PLAZ связан с зарядом молекулы PLA2.Чжан Цзинкан и др.(1981) изготовили кристаллы Agkistrodotoxin.Ту Гуанлян и др.(1983) сообщили, что токсичный PLA с изоэлектрической точкой 7,6 был выделен и очищен из яда Vipera rotundus из провинции Фуцзянь, и его физические и химические свойства, аминокислотный состав и последовательность 22 аминокислотных остатков в N -терминал определился.Ли Юешэн и др.(1985) выделили и очистили еще один PLA2 из яда Viper rotundus в провинции Фуцзянь.Субъединица PLA2* равна 13 800, изоэлектрическая точка равна 10,4, а удельная активность составляет 35/xnioI/miri мг. С лецитином в качестве субстрата оптимальный pH фермента составляет 8,0, а оптимальная температура составляет 65 °C. LD5 вводили внутривенно мышам.Она составляет 0,5 ± 0,12 мг/кг.Этот фермент обладает очевидным антикоагулянтным и гемолитическим действием.Токсичная молекула PLA2 состоит из 123 остатков 18 видов аминокислот.Молекула богата цистеином (14), аспарагиновой кислотой (14) и глицином (12), но содержит только один метионин, а ее N-конец представляет собой остаток серина.По сравнению с PLA2, выделенным Tuguang, молекулярная масса и количество аминокислотных остатков двух изоферментов очень похожи, аминокислотный состав также очень похож, но количество остатков аспарагиновой кислоты и пролина несколько отличается.Яд королевской кобры Гуанси содержит большое количество PLA2.Шу Юян и др.(1989) выделили из яда PLA2, который имеет удельную активность в 3,6 раза выше, чем у исходного яда, молекулярную массу 13000, состав из 122 аминокислотных остатков, изоэлектрическую точку 8,9 и хорошую термостабильность.Из наблюдения за действием основного PLA2 на эритроциты под электронным микроскопом видно, что он оказывает очевидное влияние на мембрану эритроцитов человека, но не оказывает очевидного влияния на эритроциты козы.Этот PLA2 оказывает явное замедляющее действие на скорость электрофореза эритроцитов у людей, коз, кроликов и морских свинок.Чен и др.Этот фермент может ингибировать агрегацию тромбоцитов, индуцированную АДФ, коллагеном и арахидоновой кислотой натрия.Когда концентрация PLA2 составляет 10 мкг/мл ~ 100 мкг/мл, агрегация тромбоцитов полностью ингибируется.Если в качестве материала использовались отмытые тромбоциты, то ФЛА2 не могла ингибировать агрегацию в концентрации 20 мкг/мл.Аспирин является ингибитором циклооксигеназы, который может ингибировать действие PLA2 на тромбоциты.PLA2 может ингибировать агрегацию тромбоцитов путем гидролиза арахидоновой кислоты с синтезом тромбоксана A2.Конформацию раствора PLA2, продуцируемого ядом Agkistrodon halys Pallas в провинции Чжэцзян, изучали с помощью кругового дихроизма, флуоресценции и УФ-поглощения.Экспериментальные результаты показали, что конформация основной цепи этого фермента аналогична конформации одноименного фермента других видов и родов, конформация скелета обладает хорошей термостойкостью, а структурные изменения в кислой среде носят обратимый характер.Сочетание активатора Са2+ и фермента не влияет на окружение остатков триптофана, а ингибитора Zn2+ наоборот.Способ, которым значение рН раствора влияет на активность фермента, отличается от указанных выше реагентов.
В процессе очистки змеиного яда PLA2 очевидным явлением является то, что змеиный яд содержит два или более пиков элюирования PLA2.Это явление можно объяснить следующим образом: ① из-за существования изоферментов;② Один вид PLA2 полимеризуется в различные смеси PLA2 с различной молекулярной массой, большинство из которых находятся в диапазоне от 9 000 до 40 000;③ Комбинация PLA2 и других компонентов змеиного яда усложняет PLA2;④ Поскольку амидная связь в PLA2 гидролизована, заряд меняется.① и ② распространены, за некоторыми исключениями, такими как PLA2 в змеином яде CrWa/w.
Возможны две ситуации: ① и ②.Третье состояние было обнаружено в PLA2 в яде следующих змей: Oxyranus scutellatus, Parademansia microlepidota, Bothrops a ^>er, палестинской гадюки, песчаной гадюки и ужасной гремучей змеи.
Результат случая ④ приводит к изменению скорости миграции PLA2 при электрофорезе, но аминокислотный состав не меняется.Пептиды могут быть разрушены гидролизом, но обычно они все еще связаны дисульфидными связями.Яд восточной гремучей змеи содержит две формы PLA2, называемые PLA2 типа a и типа p соответственно.Разница между этими двумя типами PLA2 состоит только в одной аминокислоте, то есть глутамин в одной молекуле PLA2 заменен на глутаминовую кислоту в другой молекуле PLA2.Хотя точная причина этой разницы не ясна, обычно считается, что она связана с дезаминированием PLA2.Если PLA2 в яде палестинской гадюки согреть с сырым ядом, концевых групп в молекулах ее фермента станет больше, чем раньше.Из C PLA2, выделенный из яда змеи, имеет два разных N-конца, и его молекулярная масса составляет 30000. Это явление может быть вызвано асимметричным димером PLA2, который подобен симметричному димеру, образованному PLA2 в яде восточной гремучей змеи. и западная гремучая змея с ромбовидной спиной.Азиатская кобра состоит из множества подвидов, некоторые из которых не имеют четкой классификации.Например, то, что раньше называлось подвидом кобры Внешнего Каспия, теперь признано
Ее следует отнести к Внешнекаспийской морской кобре.Так как подвидов много и они смешаны между собой, состав змеиного яда сильно различается из-за разных источников, а также высокое содержание изоферментов PLA2.Например, яд кобры.
Не менее 9 видов изоферментов PLA2 видов r^ll были обнаружены в яде кобры подвида Caspian.Дуркин и др.(1981) изучали содержание PLA2 и количество изоферментов в ядах различных змей, включая 18 ядов кобры, 3 яда мамбы, 5 ядов гадюки, 16 ядов гремучей змеи и 3 яда морской змеи.В целом активность PLA2 яда кобры высока и содержит много изоферментов.Активность PLA2 и изоферменты яда гадюки средние.Активность PLA2 яда мамбы и яда гремучей змеи очень низкая или отсутствует.Активность PLA2 яда морской змеи также низкая.
В последние годы не сообщалось, что PLA2 в змеином яде существует в форме активного димера, например, у гремучей змеи восточной ромбофоры (змеиный яд C. содержит PLA2 типа А и типа P, оба из которых состоят из двух идентичных субъединиц). , и только димераза имеет
Активность.Шен и др.также предположили, что только димер PLA2 змеиного яда является активной формой фермента.Изучение пространственной структуры также доказывает, что PLA2 западной гремучей змеи существует в виде димера.Рыбоядное соединение
Различают два разных ФЛА^Ei и E2 змеиного яда, в которых 仏 существует в виде димера, причем димер активен, а его диссоциированный мономер неактивен.Лу Инхуа и др.(1980) дополнительно изучили физические и химические свойства и кинетику реакции E. Jayanthi et al.(1989) выделили основной PLA2 (VRVPL-V) из яда гадюки.Молекулярная масса мономера PLA2 составляет 10000, обладающего летальным, антикоагулянтным и отечным действием.Фермент может полимеризовать полимеры с различной молекулярной массой в условиях рН 4,8, причем степень полимеризации и молекулярная масса полимеров увеличиваются с повышением температуры.Молекулярная масса полимера, образующегося при 96°С, составляет 53·100, а активность PLA2 этого полимера увеличивается в два раза.
Время публикации: 18 ноября 2022 г.